Chapitre V

Chapitre V

Applications : analyse de flux métaboliques, pharmacocinétiques.

III. Métabolisme in vitro du Diazepam (suite et fin)

Le modèle mathématique est le réseau des quatre équations différentielles linéaires:

dq₁/dt = - K₁ q₁

dq₂/dt = + k₂₁ q₁ - k₄₂ q₂

dq₃/dt = + k₃₁ q₁ - K₃ q₃

dq₄/dt = + k₄₂ q₂ + k₄₃ q₃ - k₀₄ q₄

V-28

à partir desquelles est construite l'équation matricielle générale :

V-29

Ici, q₁(0), q₂(0) et q₃(0) représentent respectivement la quantité de DZ de NOR ou de TEM introduite dans le milieu de culture au temps t = 0 (Fig. V-10). Lorsque l'une de ces trois valeurs est positive, les deux autres sont nulles. La matrice carrée d'ordre 4x4 présente une particularité intéressante : toutes les valeurs au-dessus de la diagonale sont nulles. Il s'agit d'une "matrice diagonale" dont le déterminant est tout simplement le produit des éléments de la diagonale, soit :

|A| = (s+K₁) (s+k₄₂) (s+K₃) (s+k₀₄)

V-30

Nous nous intéresserons essentiellement aux cinétiques consécutives à l'introduction du seul DZ (Fig. V-9) lorsque q₁(0) est positif et q₂(0) et q₃(0) sont nuls. Les transformées de Laplace F_n (n = 1, …, 4) sont obtenues comme précédemment (voir chap. I et II) en substituant la matrice scalaire résultat [[q₁(0), 0, 0 ,0]] à la colonne n de la matrice numérateur.

V-31

Les matrices au numérateur ont d'intéressantes propriétés qui facilitent l'obtention des déterminants. Celle de F₁ est une matrice diagonale dont le déterminant est égal au produit des seuls éléments de la diagonale. Dans les numérateurs de F₂, F₃ et F₄le cofacteur de (s+K₁) est nul : comme on peut facilement le vérifier le déterminant d'une matrice carrée dont tous les éléments d'une colonne et/ou d'une ligne sont nuls est nulle. Le déterminant de ces matrices au numérateur n'est donc que le produit de q₁(0) par son minorant. (voir chap. I). Des transformées on tire les fonctions :

V-32

Les coefficients exponentiels de la fonction q₄ sont :

V-33

Les expressions numériques des courbes du métabolisme de DZ (Fig. V-9) sont données en nanomoles, en considérant que l'introduction de 20 µM de DZ correspond à q₁(0) = 40 nanomoles :

q₁ = 40 e - ^{1,01 t} pour DZ,

q₂ = - 27,615 (e - ^{1,01 t -}e^{- 0,054 t}) pour NOR,

q₃ = - 13,571 (e - ^{1,01 t
-}e^{- 0,45 t}) pour TEM,

q₄ = 3,595 e - ^{1,01 t -}5,529 e^{- 0,45 t}- 9,901 e^{- 0,18 t}+ 11,835 e^{- 0,054 t} pour OX,

V-34

à partir desquelles sont calculées les microconstantes caractéristiques du système.

Les constantes exponentielles étant aussi les constantes d'exit de chacun des compartiments (éq. V-32) on a directement K₁, k₄₂, K₃ et k₀₄. Des coefficients exponentiels de q₂ et q₃ on extrait respectivement k₂₁ et k₃₁. Avec le coefficient exponentiel C₄ de q₄ (éq. V-33) on obtient la constante de production d'OX à partir de TEM soit k₄₃. Les constantes de production des métabolites non identifiés s'obtiennent par différence : k₀₁ = K₁ – (k₂₁+k₃₁) et k₀₃ = K₃ – k₄₃. Toutes ces valeurs sont rassemblées dans le tableau V-5.

Tableau V-5 : Microconstantes du métabolisme du diazepam et de ses métabolites au contact d'hépatocytes de singe en culture.

	*k₂₁*	*k₃₁*	*k₀₁*	*k₄₂*	*k₄₃*	*k₀₃*	*k₀₄*
*/ heure*	0,66	0,19	0,16	0,054	0,11	0,34	0,18

Les expériences isolées avec les métabolites purs NOR et TEM (Fig. V-9) confirment ces résultats. Après introduction de q₂(0) = 12 nanomoles de NOR (=6 µM) dans les cultures de cellules les courbes de concentrations en NOR et OX en fonction du temps sont exprimées par les équations :

q₂ = 12 e^{- 0,054 t} pour NOR,

q₄ = 5,142 (e^{- 0,054 t}- e^{-
0,18 t}) pour OX,

V-35

où l'on retrouve dans l'expression de q₂ la constante k₄₂ = 0,054 / h et dans l'expression de q₄ la constante k₀₄ = 0,18 / h. Après introduction de q₃(0) = 40 nanomoles de TEM (=20 µM) on a les équations des courbes de concentrations en NOR et OX :

q₃ = 40 e^{- 0,45 t} pour TEM,

q₄ = ^-16,296 (e^{- 0,45 t}- e^{- 0,18 t}) pour OX,

V-36

où l'on retrouve les constantes K₃ = 0,45 / h dans q₃ et k₀₄ = 0,18 / h dans q₄. Le calcul effectué avec le coefficient exponentiel de q₄ " - 16,296 = q₃(0) k₄₃ / (k₀₄ - K₃) " on obtient bien k₄₃ = 0,11 / h.

La figure V-11 schématise les réactions enzymatiques, déméthylations et hydroxylations, subies par les benzodiazépines.

Figure V-11 : Schéma de transformation du diazepam (DZ) par déméthylation (réactions horizontales) et hydroxylation (réactions verticales).

L'analyse compartimentale a permis aux auteurs d'estimer la fraction de substrat métabolisée par une voie donnée. Par exemple, DZ disparaît selon 3 voies définies par les constantes k₀₁, k₂₁ et k₃₁ et totalisant 100% du métabolisme de DZ correspondant à K₁; ainsi, la voie DZ - > métabolites non identifiés par k₀₁ vaut 15,84 % (=100 k₀₁ / K₁). Le tableau V-6 montre quelques pourcentages de DZ métabolisé en fonction de la voie de transformation chimique.

Tableau V-6 : Contribution de chaque voie de transformation chimique au métabolisme de DZ par les hépatocytes de singe entre 3 et 6 heures de culture.

*Voies métaboliques*	*% du diazepam*	*Expressions algébriques*
DZ - > NOR	65,35	100 k₂₁ / K₁
DZ - >TEM	18,81	100 k₃₁ / K₁
DZ - > NOR- > OX	65,35	100 k₂₁ k₄₂ / k₄₂
DZ - > TEM - > OX	4,60	100 k₃₁ k₄₃ / K₃
DZ - > OX (2 voies)	69,95	100 (k₂₁ k₄₂ / k₄₂+k₃₁ k₄₃ / K₃)

Seddon et coll. ont analysé les cinétiques du DZ avec des cultures plus âgées (1, 2 , 4 et 6 jours). Après 2 jours de culture les hépatocytes de singe perdent progressivement leur activité enzymatique de déméthylation sans altération significative de l'hydroxylation.

A titre d'exercice, voici quelques données adaptées des résultats de Seddon et al. obtenus avec des hépatocytes cultivés au-delà de 48 heures. L'évolution des concentrations de DZ et de ses métabolites est représentée ci-dessous (Fig. V-12). Pour q₁(0) = 40 nanomoles de DZ, nous avons les équations de s concentrations correspondant à chaque courbe :

c₁ _(µM) = 20 e^{– 0,425 t}

c₂ _(µM) = – 8,108 (e^{– 0,425 t} – e^{– 0,055 t})

c₃ _(µM) = – 11,343 (e^{– 0,425 t} – e^{– 0,45 t})

c₄ _(µM) = 2,768 e^{–0,425
t} + 9,91 e^{–0,055 t} + 45,373 e^{–0,09 t} – 58,051 e^{–0,1
t} .

V-37

Figure V-12 : Evolution in vitro des concentrations en diazepam (DZ)et de ses métabolites dans le milieu de culture (2 ml) après introduction de 40 nanomoles de DZ dans des cultures vieillissantes d'hépatocytes de singe. Symboles : cercles pleins = DZ; cercles vides = NOR; triangles pleins = TEM; triangles vides = oxazepam (OX).

Calculer toutes les microconstantes du système et la participation de chaque voie au métabolisme du DZ. Les tableaux V-7 et 8 rassemblent les résultats à obtenir.

Tableau V-7 : Microconstantes du métabolisme du diazepam et de ses métabolites au contact d'hépatocytes de singe en culture (exercice).

	*k₂₁*	*k₃₁*	*k₀₁*	*k₄₂*	*k₄₃*	*k₀₃*	*k₀₄*
*/heure*	0,15	0,19	0,085	0,055	0,04	0,05	0,1

Tableau V-8 : Contribution de chaque voie de transformation chimique au métabolisme de DZ par les hépatocytes de singe entre 3 et 6 heures de culture.

*Voies métaboliques*	*% du diazepam*	*Expressions algébriques*
DZ - > NOR	35,29	100 k₂₁ / K₁
DZ - >TEM	44,71	100 k₃₁ / K₁
DZ - > NOR- > OX	15	100 k₂₁ k₄₂ / k₄₂
DZ - > TEM - > OX	15,2	100 k₃₁ k₄₃ / K₃
DZ - > OX (2 voies)	30,2	100 (k₂₁ k₄₂ / k₄₂+k₃₁ k₄₃ / K₃)

Il apparaît que les voies de déméthylation le cèdent aux voies d'hydroxylation dont les constantes k₂₁ et k₄₂ sont préservées (Tab. V-5). Les voies d'élimination vers des produits indéterminés sont largement prédominantes (100 – 30,2 = 69,2 % contre 29,95 % avec les cultures de 3 h).

Ces analyses in vitro de pure pharmacologie montre bien que l'analyse compartimentale peut s'appliquer à des systèmes autres que des organismes vivants entiers. L'un des avantages de la culture cellulaire est d'avoir accès à pratiquement tous les compartiments du système pour y effectuer les mesures de concentration. Parce que le procédé autorise la multiplication des expériences sans crainte de porter préjudice à un organisme humain ou animal il a été préconisé comme méthode de substitution à l'expérimentation animale. Malheureusement, celle-ci reste nécessaire dans la mesure où l'environnement vivant in situ est rarement réductible à l'environnement artificiel utilisé in vitro.

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